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蛋白尿相关检测进展

日期:2017-01-20 15:10:07 来源: 中国实用儿科杂志 点击:

蛋白尿测定是肾脏疾病诊断和治疗监测的重要手段,准确评估尿蛋白水平对指导临床实践很重要。临床应关注蛋白尿实验室检测现状以及存在问题,并着重探讨临床蛋白尿检测中需重视的分析前、分析中、分析后标准化环节,包括标本收集方式、尿蛋白测定方法及标准化,以及结果报告等问题。

蛋白尿检测可以用于慢性肾脏病(chronic kidney disease,CKD)与糖尿病肾病(diabetic kidney disease,DKD)的诊断和治疗监测,也可作为终末期肾病(end stage renal disease,ESRD)、心血管疾病及全因死亡的危险预测指标[1-2]  。 

2012年肾脏病改善全球预后组织(kidney disease:improving global outcomes,KDIGO)颁布的《慢性肾脏疾病评估与管理临床实践指南》[3],对CKD的分期、评估和并发症管理进行了修正,分期结合了肾小球滤过率(glomerular filtration rate,GFR)和尿白蛋白水平(albuminuria),更有助于CKD患者诊疗和预后风险的评估。

由于儿童尿白蛋白受年龄、性别、青春期和运动的影响,早期KDIGO指南推荐中[4],对于年龄>2岁的儿童采用24 h尿蛋白排泌率(protein excretion rate,PER)或晨尿的尿蛋白/肌酐比值(protein creatinine ratio,PCR)作为尿蛋白的分级标准。随着检测技术的发展,临床实验室可以定量检测尿液中的白蛋白,大量临床研究也提示尿白蛋白/肌酐比值(albumin creatinine ratio,ACR)升高(≥10 mg/g)和估算肾小球滤过率(estimated glomerluar filtration rate,eGFR) [<60 mL/(min·1.73 m2)]是ESRD、心血管疾病和全因死亡的独立风险因素,因此,2012版KDIGO指南[3]中建议,儿童尿蛋白评估可采用ACR或尿白蛋白排泌率(albumin excretion rate,AER)测定。

准确检测蛋白尿对于正确指导临床实践很重要。临床医生除了关心尿蛋白检测的临床应用价值外,还应该了解蛋白尿实验室检测的现状,从而更好地运用蛋白尿检测项目,并有助于更合理地解读检测结果。目前,不同地区或国家的蛋白尿检测临床实践指南中,对样本收集类型、尿蛋白检测方法、报告方式、参考区间及判定值的设定推荐均不相同[5]。因此,临床和实验室有必要重视上述测定影响因素。

1  实验室检测方法

尿液蛋白可分为两类,透过肾小球滤过屏障的血浆蛋白如白蛋白和由肾小管及尿道产生的非血浆蛋白(如Tamm-Horsfall蛋白或尿调蛋白等)。白蛋白是尿液蛋白的主要组成成分,正常人尿液中的蛋白分泌少,当持续出现尿PER>150 mg/24 h或者尿AER>30 mg/24 h,定义为蛋白尿。
1.1    尿蛋白检测方法    干化学试带法(dipstick)是尿蛋白常见的定性检测方法,具有方便、灵敏的优点,主要用于蛋白尿的筛查。干化学试带法对白蛋白敏感,对免疫球蛋白及轻链不敏感,尿液白蛋白浓度<150 mg/L时,低于比色试带检测限。此外,一项大规模评估试带法对蛋白尿检测准确性的研究发现 [6]: 以ACR≥30 mg/g 或ACR≥300 mg/g作为参考测定方法,试带法检测结果阴性具有很高的阴性预测价值, ACR ≥30 mg/g 组和ACR≥300 mg/g组, 试带法阴性预测值分别为97.6%和100%, 但较高的假阳性率使得干化学试带法蛋白测定结果需要进一步做尿蛋白定量检测进行确认。

染料结合-化学显色法如邻苯三酚钼络合显色法是利用试剂中的邻苯三酚红与钼酸形成复合物,之后与蛋白结合显色的原理对尿蛋白定量检测。染料结合-化学显色法敏感性适中、干扰因素较少,并可实现检测的自动化,是尿蛋白定量检测的常用方法。
1.2    尿白蛋白检测方法    尿液中白蛋白并非只有单一形式存在。白蛋白作为重要的血浆运载蛋白,与离子、肽链、激素以及药物的结合会改变其分子构象,会存在蛋白水解产生的白蛋白碎片或化学修饰产生的二聚体、多聚体等形式 [5,7]。白蛋白碎片或被修饰的白蛋白往往失去部分或全部免疫原性,不同类型尿白蛋白的临床意义还不清楚。

尿白蛋白的实验室检测方法可分为免疫化学法和体积排阻高效液相色谱法(size-exclusion high-performance liquid chromatography,SE-HPLC)[8]。目前,临床常规应用的免疫化学法主要包括免疫散射比浊法和免疫透射比浊法等,一般适用于检测具有免疫反应性且分子质量>12 ku的白蛋白,检测限为2~10 mg/L。

免疫散射比浊法和免疫透射比浊法是尿白蛋白检测常用方法,两者均采用特异抗体与尿中白蛋白形成复合物,透射比浊法的灵敏度常低于散射比浊法,但通过乳胶增强的方法可以提高其检测灵敏度。

SE-HPLC法可以检测免疫反应性和免疫非反应性白蛋白。相比免疫化学法,SE-HPLC法对白蛋白检测更为灵敏,但其特异度不高,难以区分尿液中与白蛋白近似分子量大小的蛋白质【9】,从而会高估白蛋白尿。

不同试剂厂商能检测的尿白蛋白类型可能不同,尿白蛋白分子异质性对准确检测尿白蛋白是一种挑战。

2  尿液标本留取方式及分析前影响因素

2.1    定时尿液标本    由于尿白蛋白排泄在个体内的变异为4%~103% [5],而24 h尿液标本可以较好地消除个体一天内不同时段生理变异因素的影响,因此,早期实验室多采用24 h尿PER或24 h尿AER评估蛋白尿。但由于24 h尿标本留取费时、不便、患者顺从性差的缺点,很难在临床大规模开展监测与筛查时使用。因此,CKD临床实践指南推荐采用点尿样进行尿蛋白的检测[3]。但在某些情况下,比如肌酐分泌不稳定的急性肾损伤患者、大量蛋白尿患者以及极端年龄和体重的患者,定时尿对蛋白尿的评估仍具有重要作用[10]。
2.2    随机尿液标本    晨尿和随机尿是临床上常用的标本检测类型。由于个体内变异较大,尿蛋白或白蛋白检测通常用尿肌酐进行矫正。相比随机尿,首次晨尿受到饮水和生理活动的影响较小,与24 h尿蛋白的相关性更强,因此,KDIGO指南推荐使用首次晨尿PCR和ACR作为PER和AER的替代指标, 用于评估蛋白尿, 但也可以接受随机尿进行蛋白尿检测[4]。在临床诊断和随访中, 常检测一段时间内多次尿样的PCR和ACR来评估蛋白尿水平。 如儿童2型糖尿病患者在并发症的评估治疗中, 诊断之初应进行尿ACR的检测, 并且应此后每年检测1次。如检测结果升高, 需重复2~3次进行确定, 以便及时使用血管紧张素转换酶抑制剂治疗[11]。

一项针对门诊患者的研究发现[12],尿PCR能准确预测尿蛋白≥ 150 mg/24 h和显著蛋白尿(尿蛋白>300 mg/24 h),受试者工作特征曲线 (receiver-operator characteristic curve,ROC)下面积分别为0.90~0.92、0.97~1.00。尿ACR也能准确预测尿白蛋白≥30 mg/24 h和显著白蛋白尿(尿白蛋白≥300 mg/24 h)。 
2.3    尿液样本收集和储存    尿白蛋白测定样本的长期储存条件和稳定性目前有不同的推荐方式[5],尿蛋白检测建议采用新鲜的中段尿标本,2~8℃储存的尿液标本白蛋白可以稳定7 d,-80℃可以长期保存,而-20℃长期保存会有各种白蛋白修饰产物产生[13]。

3  尿白蛋白检测的标准化

尿液总蛋白组成成分复杂多样, 被检测者不同健康状态和疾病情况下, 尿液的蛋白种类和所占比例差异较大, 从而很难实现尿总蛋白检测的标准化。尿白蛋白检测系统也因检测原理不同、试剂反应性不同而使检测结果存在一定的差异。国内临床实验室尿蛋白检测调研数据显示: 尿白蛋白室间质评正确度验证试验, 52家参与实验室仅有36.5%验证合格, 其中采用散射比浊法和透射比浊法的实验室验证合格率分别为55.6%42.9%[14]。

Bachmann等[15]以同位素稀释质谱法作为参考方法,比较了17种尿白蛋白定量常规检测方法的不精密度和偏倚情况,结果显示,尿白蛋白浓度在 15 mg/L时,各方法与参考方法的平均偏倚范围从-35%至34%。因此,尿白蛋白检测急需国际认可的参考物质和参考检测程序,确保检测结果的准确性和可比性。

自2009年美国肾脏病教育计划(national kidney disease education program, NDKEP)实验室工作组及国际临床化学协会(IFCC)联合启动尿白蛋白检测标准化计划以来, 尿白蛋白检测候选参考物质的制备和候选参考测量程序的建立极大地推进了尿白蛋白检测标准化进程[16]。

联合工作组推荐使用液相色谱串联质谱法(liquid chromatography tandem mass spectrometry,LC-MS/MS)作为尿白蛋白候选参考测量程序检测尿白蛋白[15-17]。候选参考物质可以用于标准品的赋值。目前,多数尿白蛋白检测的标准品能溯源到血清白蛋白候选参考物质ERM-DA470K/IFCC,或者纯化人血清白蛋白。免疫学检测方法不适用于作为尿白蛋白测定的参考测量程序,因为不同抗体分子可能和白蛋白或降解的蛋白碎片不同位点反应导致实验室测量结果不同。 

ACR的变异来源于测定尿白蛋白和肌酐的不精密度和偏倚,肌酐和尿蛋白的标准化测定可以使不同地方不同方法学所获得的ACR值具有可比性,目前我国尚未颁布统一的尿白蛋白检测指南,建议患者在同一家实验室进行随访检测,以保证结果前后的可比性。

4  结果报告方式和检测项目的选择

目前尿蛋白检测结果常见报告方式有:尿蛋白浓度(单位mg/L),尿PER或AER(单位:mg/24 h),每分钟尿 PER 或 AER(单位: μg/min)和尿 PCR 或ACR值(单位: mg/mmol或者mg/g), 这种现状难以统一。一项来自于英国小儿糖尿病护理的调查结果显示, 绝大部分机构(81%)选择测定晨尿ACR筛查蛋白尿, 14%的实验室采用定时过夜尿收集, 仅5%的实验室采用收集24 h尿筛查尿蛋白[18]。

一项3481例慢性肾功能不全的人群队列研究显示,ACR和PCR与CKD常见临床结局均有良好相关性[19]。另外一项6842例CKD人群结果则显示,尿PCR和ACR两者之间并不呈线性相关,且PCR与24 h尿总蛋白定量的相关性优于ACR,PCR预测蛋白尿水平(0.5 g/24 h、1.0 g/24 h)时,ROC曲线下面积优于ACR,且较ACR在筛查临床蛋白尿时更灵敏,但两者的诊断效能随年龄、性别变化,临床在解释结果时需考虑。研究提示,PCR更适合评估非糖尿病性CKD患者[20]。针对2型DKD患者的研究结果则显示,晨尿ACR较PER、AER能更好地预测2型糖尿病患者肾脏事件的发生(如ESRD或肌酐双倍升高)[21]。

综合目前研究和尿白蛋白检测成本高等因素,对于选择尿总蛋白还是尿白蛋白用于肾脏疾病的诊断和治疗监测,目前国内尚没有统一定论。尿PCR或ACR均可用于一般人群筛查;尿ACR更适用于DKD和其他肾小球疾病筛查,而尿PCR可能更适用于肾小管间质性疾病筛查,因为此时视黄醇结合蛋白、肽类激素、β2微球蛋白和轻链等是尿蛋白的主要变化组分。

采用尿肌酐进行校正的ACR和PCR分别代表着单位肌肉量的AER和PER,因此,其与年龄、性别和种族等因素有关,而目前的蛋白尿参考区间以及临床判断值并未考虑到尿肌酐排泄率的因素。采用包含年龄和性别的公式对ACR和PCR进行校正,也许能更好地评估蛋白尿。Hong等 [22] 基于eGFR的两个计算公式(MDRD和CKD-EPI)估算出肌酐的排泌率,然后转换PCR和ACR,得出估算尿蛋白分泌率(estimated protein excretion rate,ePER)和估算尿白蛋白分泌率(estimated albumin excretion rate,eAER)。结果显示,MDRD和CKD-EPI两种公式计算的ePER和eAER在评估每日蛋白尿水平时优于PCR和ACR。

综上所述,蛋白尿检测具有重要的临床意义,但尿标本收集标准化、蛋白尿检测方法一致性、结果报告方式的一致性、不同人群的尿蛋白正常参考区间以及合适的临床判断值等问题还没有完全解决。因此,不断改善蛋白尿检测的现状,提供准确可比的检测结果,有助于肾脏疾病的临床诊疗和预后评估。

参考文献 (略)



(责任编辑:xgh)

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